Продуктивный тип взаимодействия вируса. Этапы взаимодействия вирусов с чувствительными клетками и факторы, способные их нарушать. Отличия вирусов от других организмов

Вирусные частицы, или вирионы являются инертны­ми, статическими формами вируса. Когда вирионы находятся вне клетки, они не репродуцируются. В настоящее время известно три типа взаимодействия вирусов с клетками хозяина.

Продуктивный тип взаимодействия заканчивается образова­нием вирусного потомства.

Абортивный тип не завершается образованием вирусных час­тиц, поскольку инфекционный процесс прерывается и не сопро­вождается формированием инфекционного потомства.

Интегративный тип взаимодействия вирусов с клеткой харак­терен для онкогенных вирусов, нуклеиновая кислота которых спо­собна встраиваться (интегрироваться) в клеточную хромосому, вызывая трансформацию клеток. Границы между вирусами с ав­тономной репликацией геномов и интеграционными вирусами довольно условны, и один и тот же вирус, в зависимости от вида клеток, может вести себя либо как инфекционный, либо как ин­теграционный геном. Результатом такого взаимодействия вируса и клетки является изменение наследственных свойств клетки. Данный тип взаимодействия вируса и клетки называют вироге-

нией, подобно лизогении при взаимодействии фагов с бактерия­ми. Вирусы, способные вызывать вирогению, относят к группе умеренных.

Продуктивный тип взаимодействия вируса и клетки получил название репродукции вирусов (от англ. rерroduсе - воспроизво­дить). Репродукция вирусов - это образование по принципу комплементарности и путем репликации копий вирусных нуклеиновых кислот и индуцирование молекулами последних биосинтеза вирусных белков с последующей самоорганизацией этих компонентов в вирусные частицы.

Синтез и репликацию нуклеиновых кислот вирусов осуществляют ферменты. Используя нуклеотиды клетки, ферменты создают из них полинуклеотидные цепи новых молекул нуклеиновых. кислот вирусов. В зависимости от типа синтезируемых нуклеиновых кислот они называются ДНК-полимеразами или РНК-синтетазами. В некоторых случаях нуклеиновые кислоты вирусов реплицируются клеточными полимеразами - ферментами, присутствующими в клетке до ее заражения вирусом, хотя чаще репликацию вирусных нуклеиновых кислот осуществляют полимеразы, появляющиеся после заражения клетки вирусом. Такие полимеразы называют вирусспецифическими, так как биосинтез их закодирован в структуре нуклеиновых кислот самих вирусов. И, наконец, репликация нуклеиновых кислот некоторых вирусов происходит за счет предсуществующих в вирионе полимераз. Синтез вирусспецифических полимераз и вирусных структурных белков осуществляется на рибосомах клетки. Вирусные полимеразы, например РНК-репликазы, являются строго специфичными.

При большом разнообразии механизмов репродукции вирусов общим для них является то, что источником мономеров для синтеза и репликации нуклеиновых кислот служат нуклеотиды клетки. Источником мономеров для синтеза и построения белков всех вирусов являются аминокислоты, и синтез белков всех вирусов независимо от ультраструктуры их нуклеиновых кислот осуществляется в клеточных рибосомах. Источником энергии для биосинтетических процессов при репродукции вирусов является АТФ, которая вырабатывается в митохондриях клет­ки-хозяина.

Процесс репродукции вирусов включает шесть этапов: адсор­бцию вируса на клетке; проникновение в клетку; депротеинизацию и освобождение вирусного генома; синтез вирусных компо­нентов в клетке-хозяине; сборку и формирование вирусов; выход зрелых вирусов из клетки.

Адсорбция, то есть прикрепление ви руса к клетке, осущес­твляется специфическими и неспецифическими механизмами. Неспецифический - определяется силами электростатического

взаимодействия. В этом процессе участвуют положительно заря­женные аминные группы вирусного белка и кислые фосфатные группы клеточной поверхности, имеющие отрицательный заряд. Специфический механизм взаимодействия вируса и клетки обус­ловлен комплементарными клеточными и вирусными рецепто­рами. Вирусные рецепторы подразделяют на липопротеиновые (у арбовирусов) и мукопротеиновые (у миксовирусов и аденовирусов). Спектр чувствительности клеток к вирусам часто опреде­ляется наличием соответствующих рецепторов.

Резистентность клеток можно преодолеть путем разрушения клеточной мембраны, для чего используют инактивированный вирус Сендай. Специфические противовирусные антитела и ан­титела к нормальным клеткам препятствуют адсорбции виру­сов. Процесс адсорбции состоит из двух периодов - обратимого и необратимого. Период обратимой адсорбции может закончить­ся десорбцией вируса. При длительном контакте клеток и вируса наступает стадия необратимой адсорбции. Адсорбированные вирионы таким образом могут частично элюироваться с поверхнос­ти клеток, небольшая часть остается интактной, а основная масса вирусных частиц проникает в клетку.

Проникновение вирусов в клетку осуществляется путем ви-ропексиса, или пиноцитоза. При этом в месте адсорбции вириона происходит сначала инвагинация наружной мембраны клетки и образование внутриклеточной вакуоли с вирусной частицей. Че­рез некоторое время вирусная и клеточная мембраны вакуоли лизируются и высвобождается нуклеокапсид вируса. Другие виру­сы, например вирус Неrреs simр1ех, проникают в клетку не путем виропексиса, а расплавления мембран вируса и клетки. После расплавления вирусный нуклеопротеид оказывается в цитоплаз­ме. Большинство вирусов проникают в клетку путем виропекси­са, меньшинство видов - путем сплавления. У фагов этот про­цесс, то есть освобождение ДНК и ее последующая инъекция сквозь оболочку бактериальной клетки, происходит непосредст­венно на поверхности этой клетки сразу же после прикрепления к ней фага.

Депротеинизация, или «раздевание» происходит постепенно в несколько этапов. Процесс освобождения вирусной нуклеино­вой кислоты идет при активном участии самого вируса, индуци­рующего образование в клетке ферментов и активаторов фермен­тов, необходимых для депротеинизации вирусной нуклеиновой кислоты. В процессе депротеинизации вирусов могут участвовать ферменты клеточных лизосом. Таким образом, депротеинизация завершается освобождением вирусного генома.

Как только вирусный геном освобождается от белка, вирус­ная нуклеиновая кислота дезорганизует работу клеточных систем. Вирус стимулирует синтез ингибитора клеточных РНК. Ингиби-

тор представляет собой белок - гистон, кроме того блокирующий процесс синтеза клеточной ДНК. Второй «ранний» вирусный белок препятствует осуществлению функции клеточной и-РНК. Термин «ранние» обозначает молекулы, синтезированные до репликации ДНК.

Реализация генетической информации вирусов осуществля­ется в соответствии с процессами транскрипции - синтеза ин­формационных РНК, комплементарных матричным ДНК или РНК; трансляции - синтеза белков на рибосомах клетки с участием и-РНК; репликации - синтеза молекул нуклеиновой кислоты, гомологичных геному (рис. 7).

| Синтез вирусных ДНК у ДНК-содержащих вирусов осущес­твляется с помощью ДНК-полимераз. Благодаря участию этого фермента из нуклеотидов клетки синтезируется и строится вторая комплементарная нить ДНК, в результате чего образуются новые двухцепочечные молекулы ДНК. Процесс репликации молекул ДНК продолжается до тех пор, пока в клетке не накопится определенное их количество, необходимое для потомства вирусной частицы, проникшей в клетку.

Поскольку типы и формы нуклеиновых кислот разнообразны - кроме двухцепочечной ДНК могут быть РНК, одно- и двухцепочечные, линейные и кольцевые молекулы - то и механизмы их репликации различны.

У вирусов, содержащих двунитевуюРНК, синтез вирусных компонентов происходит сходным образом. «Ранняя» транскрип­ция у них осуществляется благодаря вирионному ферменту - РНК-зависимой РНК-полимеразе. Вирусы с однонитевой РНК по характеру синтеза белков разделяются на две группы: вирусы,

Типы взаимодействия вируса с клеткой (формы инфекции):

Ø продуктивный – репродукция вируса с образованием новых вирионов и гибелью клетки;

Ø абортивный – нарушение репродукции вируса на одном из этапов;

Ø интегративный (вирогения) – встраивание вирусной нуклеиновой кислоты в клеточный геном в виде провируса.

Клетка может быть поражена только одним вирусом – это явление получило название феномена интерференции.

Стадии взаимодействия вируса с клеткой:

1. Адсорбция вируса на рецепторах чувствительной клетки с помощью прикрепительных белков капсида/гликопротеиновых шипиков суперкапсида – происходит в две фазы:

Ø неспецифическая – электростатическое межмолекулярное притяжение (обратима);

Ø специфическая – комплементарное связывание рецепторов чувствительной клетки и вируса, обусловленное структурной гомологией (необратима).

2. Проникновение вируса в клетку – может происходить несколькими путями:

Ø рецепторный эндоцитоз (виропексис) – впячивание ЦПМ внутрь клетки с захватом вируса и образованием эндосомы с последующим слиянием оболочек вируса и вакуоли;

Ø слияние ЦПМ клетки и оболочки вируса (только сложноустроенные вирусы);

Ø впрыскиванием нуклеиновой кислоты (бактериофаги).

3. Раздевание (депротеинизация) вириона – освобождение нуклеиновой кислоты вируса, начинается сразу же после прикрепления вируса к рецептору клетки и продолжается в эндосоме, а также в цитоплазме клетки.

4. Эклипс-фаза (фаза затемнения) – репликация нуклеиновой кислоты и синтез вирусных белков, протекает в три стадии:

Ø синтез «ранних» белков – ферментов репликации;

Ø транскрипция, трансляция и репликация нуклеиновой кислоты;

Ø синтез «поздних» белков (капсидных).

Репликация нуклеиновой кислоты, как правило, происходит в ядре, а синтез белков – на рибосомах в цитоплазме, поэтому репродукцию вирусов называют дизъюнктивной/разобщенной.

5. Сборка вириона – вирусные белки и нуклеиновая кислота узнают друг друга и самопроизвольно соединяются, происходит сборка нуклеокапсида на мембранах эндоплазматической сети и аппарате Гольджи.

6. Выход вируса из клетки следующими путями:

Ø лизиса (взрыва) клетки (простоустроенные вирусы);

Ø почкованием (экзоцитозом) с захватом части ЦПМ, из которой образуется суперкапсид сложноорганизованных вирусов;

Ø просачиванием через поры ЦПМ клетки без ее гибели (только очень мелкие вирусы).

Наряду с полноценными вирионами в процессе репродукции формируются необычные по структуре и функции вирусные частицы:

Псевдовирионы – это вирионы, содержащие помимо собственной нуклеиновой кислоты и фрагменты нуклеиновой кислоты клетки-хозяина/другого вируса.

Вирусы-мутанты – это вирионы, по структуре и фенотипу отличающиеся от родительского (дикого штамма), но имеющие его генетическую основу. Известно 4 класса вирусов-мутантов:

Ø вирусы с условно-дефектными геномами – имеют мутантные геномы, дефектные при определенных условиях (изменение температуры, смена хозяина и др.);

Ø дефектные интерферирующие частицы (ДИ-частицы) – вирионы, у которых отсутствует часть геномной РНК/ДНК, но сохранены структурные белки;

Ø интеграционные вирусы с дефектным геномом – мутантные вирионы, геномы которых встроены в хромосому клетки-хозяина, потерявшие способность превращаться в полноценный вирус.

№ 26 Типы взаимодействия вируса с клеткой. Стадии ре­продукции вирусов.

Типы взаимодействия вируса с клеткой. Различают три типа взаимодействия вируса с клеткой: продуктивный, абортивный и ин-тегративный.

Продуктивный тип - завершается обра­зованием нового поколения вирионов и ги­белью (лизисом) зараженных клеток (цитоли-тическая форма). Некоторые вирусы выходят из клеток, не разрушая их (нецитолитическая форма).

Абортивный тип - не завершается обра­зованием новых вирионов, поскольку инфек­ционный процесс в клетке прерывается на одном из этапов.

Интегративный тип, или вирогения - характеризуется встраиванием (интеграцией) вирусной ДНК в виде провируса в хромосому клетки и их совместным сосуществованием (совместная репликация).

Репродукция вирусов осуществляется в несколько стадий, последовательно сменяющих друг друга: адсорбция вируса на клетке; проникновение вируса в клетку; «раздевание» вируса; биосинтез вирусных компонентов в клетке; формирование вирусов; выход вирусов из клетки.

Адсорбция. Взаимодействие вируса с клеткой начинается с процесса адсорбции, т. е. прикрепления вирусов к поверхности клетки. Это высокоспецифический процесс. Вирус адсорбирует­ся на определенных участках клеточной мембраны - так назы­ваемых рецепторах. Клеточные рецепторы могут иметь разную хи­мическую природу, представляя собой белки, углеводные ком­поненты белков и липидов, липиды. Число специфических ре­цепторов на поверхности одной клетки колеблется от 10 4 до 10 5 . Следовательно, на клетке могут адсорбироваться десятки и даже сотни вирусных частиц.

Проникновение в клетку. Существует два способа проникнове­ния вирусов животных в клетку: виропексис и слияние вирусной оболочки с клеточной мембраной. При виропексисе после адсорб­ции вирусов происходят инвагинация (впячивание) участка кле­точной мембраны и образование внутриклеточной вакуоли, ко­торая содержит вирусную частицу. Вакуоль с вирусом может транс­портироваться в любом направлении в разные участки цитоплаз­мы или ядро клетки. Процесс слияния осуществляется одним из поверхностных вирусных белков капсидной или суперкапсидной оболочки. По-видимому, оба механизма проникновения вируса в клетку не исключают, а дополняют друг друга.

«Раздевание». Процесс «раздевания» заключается в удалении защитных вирусных оболочек и освобождении внутреннего ком­понента вируса, способного вызвать инфекционный процесс. «Раздевание» вирусов происходит постепенно, в несколько этапов, в определенных участках цитоплазмы или ядра клетки, для чего клетка использует набор специальных ферментов. В случае проникновения вируса путем слияния вирусной оболочки с кле­точной мембраной процесс проникновения вируса в клетку со­четается с первым этапом его «раздевания». Конечными продук­тами «раздевания» являются сердцевина, нуклеокапсид или нук­леиновая кислота вируса.

Биосинтез компонентов вируса. Проникшая в клетку вирусная нуклеиновая кислота несет генетическую информацию, которая успешно конкурирует с генетической информацией клетки. Она дезорганизует работу клеточных систем, подавляет собственный метаболизм клетки и заставляет ее синтезировать новые вирус­ные белки и нуклеиновые кислоты, идущие на построение ви­русного потомства.

Реализация генетической информации вируса осуществляет­ся в соответствии с процес­сами транскрипции, трансляции и репликации.

Формирование (сборка) вирусов. Синтезированные вирусные нуклеиновые кислоты и белки обладают способностью специфи­чески «узнавать» друг друга и при достаточной их концентра­ции самопроизвольно соединяются в результате гидрофобных, со­левых и водородных связей.

Существуют следующие общие принципы сборки вирусов, имеющих разную структуру:

1. Формирование вирусов является многоступенчатым процессом с образованием промежуточных форм;

2. Сборка просто устроенных вирусов заключается во взаимодей­ствии молекул вирусных нуклеиновых кислот с капсидными белками и образовании нуклеокапсидов (например, вирусы полиомиелита). У сложно устроенных вирусов сначала форми­руются нуклеокапсиды, с которыми взаимодействуют белки суперкапсидных оболочек (например, вирусы гриппа);

3. Формирование вирусов происходит не во внутриклеточной жидкости, а на ядерных или цитоплазматических мембранах клетки;

4. Сложно организованные вирусы в процессе формирования включают в свой состав компоненты клетки-хозяина (липиды, углеводы).

Выход вирусов из клетки. Различают два основных типа выхо­да вирусного потомства из клетки. Первый тип - взрывной - характеризуется одновременным выходом большого количества вирусов. При этом клетка быстро погибает. Такой способ выхода характерен для вирусов, не имеющих суперкапсидной оболочки. Второй тип - почкование. Он присущ вирусам, имеющим суперкапсидную оболочку. На заключительном этапе сборки нук­леокапсиды сложно устроенных вирусов фиксируются на клеточ­ной плазматической мембране, модифицированной вирусными белками, и постепенно выпячивают ее. В результате выпячива­ния образуется «почка», содержащая нуклеокапсид. Затем «поч­ка» отделяется от клетки. Таким образом, внешняя оболочка этих вирусов формируется в процессе их выхода из клетки. При та­ком механизме клетка может продолжительное время продуци­ровать вирус, сохраняя в той или иной мере свои основные функции.

Время, необходимое для осуществления полного цикла реп­родукции вирусов, варьирует от 5-6 ч (вирусы гриппа, нату­ральной оспы и др.) до нескольких суток (вирусы кори, адено­вирусы и др.). Образовавшиеся вирусы способны инфицировать новые клетки и проходить в них указанный выше цикл репро­дукции.

Процесс репродукции вирусов условно можно разделить на 2 фазы. Пер­вая фаза включает 3 стадии : 1) адсорбцию вируса на чувствительных клетках; 2) проникновение вируса в клетку; 3) депротеинизацию вируса. Вторая фаза включает стадии реализации вирусного генома : 1) транскрипцию, 2) трансля­цию, 3) репликацию, 4) сборку, созревание вирусных частиц и 5) выход вируса из клетки.

Взаимодействие вируса с клеткой начинается с процесса адсорбции, т. е. с прикрепления вируса к поверхности клетки.

Адсорбция представляет собой специфическое связывание вирионного белка (антирецептора) с комплементарной структурой клеточной поверхности — клеточным рецептором. По химической природе рецепторы, на которых фикси­руются вирусы, относятся к двум группам: мукопротеидным и липопротеидным. Вирусы гриппа, парагриппа, аденовирусы фиксируются на мукопротеидных рецепторах. Энтеровирусы, вирусы герпеса, арбовирусы адсорбируются на липопротеидных рецепторах клетки. Адсорбция происходит лишь при наличии определённых электролитов, в частности ионов Са2+, которые нейтрализуют из­быточные анионные заряды вируса и клеточной поверхности и уменьшают электростатическое отталкивание Адсорбция вирусов мало зависит от темпера­туры Начальные процессы адсорбции носят неспецифический характер, явля­ются результатом электростатического взаимодействия положительно и отрица­тельно заряженных структур на поверхности вируса и клетки, а затем наступает специфическое взаимодействие прикрепительного белка вириона со специфи­ческими группировками на плазматической мембране клетки. Простые вирусы человека и животных содержат прикрепительные белки в составе капсида. У сложно организованных вирусов прикрепительные белки входят в состав супер-капсида. Они могут иметь форму нитей (фибры у аденовирусов), либо шипов, грибоподобных структур у миксо-, ретро-, рабдо- и других вирусов. Вначале происходит единичная связь вириона с рецептором — такое прикрепление не­прочное — адсорбция носит обратимый характер. Чтобы наступила необратимая адсорбция, должы появиться множественные связи между рецептором вируса и рецептором клетки, т. е. стабильное мультивалентное прикрепление. Количество специфических рецепторов на поверхности одной клетки составляет 10 4 -10 5 . Рецепторы для некоторых вирусов, например, для арбовирусов. содержатся на клетках как позвоночных, так и беспозвоночных, для других вирусов только на клетках одного или нескольких видов.

Проникновение вирусов человека и животных в клетку происходит двумя путями: 1) виропексисом (пиноцитозом); 2) слиянием вирусной суперкапсидной оболочки е клеточной мембраной. Бактериофаги имеют свой механизм проник­новения, так называемый шприцевои, когда в результате сокращения белкового отростка фага нуклеиновая кислота как бы впрыскивается в клетку.

Депротеинизация вируса освобождение геиома вируса от вирусных за­щитных оболочек происходит либо с помощью вирусных ферментов, либо с помощью клеточных ферментов. Конечными продуктами депротеинизации яв­ляются нуклеиновые кислоты или нуклеиновые кислоты, связанные с внутрен­ним вирусным белком. Затем имеет место вторая фаза вирусной репродукции, ведущая к синтезу вирусных компонентов.

Транскрипция — переписывание информации с ДНК или РНК вируса на и-РНК по законам генетического кода.

Трансляция — процесс перевода генетической информации, содержащейся в и-РНК, на специфическую последовательность аминокислот.

Репликация — процесс синтеза молекул нуклеиновых кислот, гомологич­ных вирусному геному.

Реализация генетической информации у ДНК-содержащих вирусов идёт так же, как и в клетках:

ДНК транскрипция и-РНК трансляция белок

РНК транскрипция и-РНК трансляция белок

У вирусов с позитивным РНК-геномом (тогавирусы, пикорнавирусы) транскрипция отсутствует:

РНК трансляция белок

У ретровирусов — уникальный путь передачи генетической информации:

РНК обратная транскрипция ДНК транскрипция и-РНК трансляция белок

ДНК интегрируется с геномом клетки-хозяина (провирус).

После наработки клеткой вирусных компонентов наступает последняя стадия вирусной репродукции сборка вирусных частиц и выход вирионов из клетки. Выход вирионов из клетки осуществляется двумя путями: 1) путём «взрыва» клетки, в результате чего клетка разрушается. Этот путь присущ про­стым вирусам (пикорна-, рео-, папова- и аденовирусам), 2) выход из клеток пу­тём почкования. Присущ вирусам, содержащим суперкапсид. При этом способе клетка сразу не погибает, может дать многократное вирусное потомство, пока не истощатся её ресурсы.

Методы культивирования вирусов

Для культивирования вирусов в лабораторных условиях используются ледуюшие живые объекты: 1) культуры клеток (тканей, органов); 2) куриные мбрионы; 3) лабораторные животные.

Культуры клеток

Наибольшее распространение имеют однослойные культуры клеток, которые можно разделить на 1) первичные (первично трипсинизированные), 2) полуперевиваемые (диплоидные) и 3) перевиваемые.

По происхождению они классифицируются на эмбрионштьные, опухолевые и из взрослых организмов; по морфогенезу — на фибробластные, эпителиальные и др.

Первичные культуры клеток — это клетки какой-либо ткани человека или животного, которые имеют способность расти в виде монослоя на пластмассо­вой или стеклянной поверхности, покрытой специальной питательной средой. Срок жизни таких культур ограничен. В каждом конкретном случае их получа­ют из ткани после механического измельчения, обработки протеолитическими ферментами и стандартизации количества клеток. Первичные культуры, полу­ченные из почек обезьян, почек эмбриона человека, амниона человека, куриных эмбрионов, широко используются для выделения и накопления вирусов, а также для производства вирусных вакцин.

Полуперевиваемые (или диплоидные ) культуры клеток — клетки одного типа, способные in vitro выдерживать до 50-100 пассажей, сохраняя при этом свой исходный диплоидный набор хромосом. Диплоидные штаммы фибробластов эмбриона человека используются как для диагностики вирусных инфек­ций, так и при производстве вирусных вакцин.

Перевиваемые клеточные линии характеризуются потенциальным бес­смертием и гетероплоидным кариотипом.

Источником перевиваемых линий могут быть первичные клеточные культуры (например, СОЦ, ПЭС, ВНК-21 — из почек однодневных сирийских хомяков; ПМС — из почки морской свинки и др.) отдельные клетки которых об­наруживают тенденцию к бесконечному размножению in vitro. Совокупность изменений, приводящих к появлению из клеток таких особенностей, называют трансформацией, а клетки перевиваемых тканевых культур — трансформиро­ванными.

Другим источником перевиваемых клеточных линий являются злокачест­венные новообразования. В этом случае трансформация клеток происходит in vivo. Наиболее часто в вирусологической практике применяются такие линии перевиваемых клеток: HeLa — получена из карциномы шейки матки; Нер-2 — из карциномы гортани; Детройт-6 — из метастаза рака лёгкого в костный мозг; RH — из почки человека.

Для культивирования клеток необходимы питательные среды, которые по своему назначению делятся на ростовые и поддерживающие. В составе росто­вых питательных сред должно содержаться больше питательных веществ, чтобы обеспечить активное размножение клеток для формирования монослоя. Поддерживающие среды должны обеспечивать лишь переживание клеток в уже сформированном монослое при размножении в клетке вирусов.

Широкое применение находят стандартные синтетические среды, напри­мер, синтетическая среда 199 и среда Игла. Независимо от назначения все пита­тельные среды для культур клеток конструируются на основе сбалансированно­го солевого раствора. Чаще всего им является раствор Хенкса. Неотъемлемый компонент большинства ростовых сред — сыворотка крови животных (телячья, бычья, лошадиная), без наличия 5-10% которой размножение клеток и форми­рование монослоя не происходит. В состав поддерживающих сред сыворотка не входит.

Выделение вирусов в культурах клеток и методы их индикации.

При выделении вирусов из различных инфекционных материалов от больного (кровь, моча, фекалии, слизистые отделяемые, смывы из органов) применяют культуры клеток, обладающие наибольшей чувствительностью к предполагаемому вирусу. Для заражения используют культуры в пробирках с хорошо развитым монослоем клеток. Перед заражением клеток питательную среду удаляют и в каждую пробирку вносят по 0,1-0,2 мл взвеси испытуемого материала, предварительно обработанного антибиотиками для уничтожения бактерий и грибов. После 30-60 мин. контакта вируса с клетками удаляют избы­ток материала, вносят в пробирку поддерживающую среду и оставляют в тер­мостате до выявления признаков размножения вируса.

Индикатором наличия вируса в заражённых культурах клеток может слу­жить:

1) развитие специфической дегенерации клеток — цитопатическое действие ви­руса (ЦПД), которое имеет три основных типа: кругло- или мелкоклеточная дегенерация; образование многоядерных гигантских клеток — симпластов; развитие очагов клеточной пролиферации, состоящих из нескольких слоев клеток;

2) обнаружение внутриклеточных включений, располагающихся в цитоплазме и ядрах пораженных клеток;

3) положительная реакция гамагтлютинации (РГА);

4) положительная реакция гемадсорбции (РГАдс);

5) феномен бляшкообразования: монослой зараженных вирусом клеток покры­вается тонким слоем агара с добавлением индикатора нейтрального красно­го (фон — розовый). При наличии вируса в клетках образуются бесцветные зоны («бляшки») на розовом фоне агара.

6) при отсутствии ЦПД или ГА можно поставить реакцию интерференции: ис­следуемая культура повторно заражается вирусом, вызывающим ЦПД. В по­ложительном случае ЦПД будет отсутствовать (реакция интерференции по­ложительная). Если в исследуемом материале вируса не было, наблюдается ЦПД.

Выделение вирусов в куриных эмбрионах.

Для вирусологических исследований используют куриные эмбрионы 7-12-дневного возраста.

Перед заражением определяют жизнеспособность эмбриона. При овоско-пировании живые эмбрионы подвижны, хорошо виден сосудистый рисунок. Простым карандашом отмечают границы воздушного мешка. Заражают кури­ные эмбрионы в асептических условиях, стерильными инструментами, предва­рительно обработав скорлупу над воздушным пространством йодом и спиртом.

Методы заражения куриных эмбрионов могут быть различны: нанесение вируса на хорион-аллантоисную оболочку, в амниотическую и аллантоисную полости, в желточный мешок. Выбор метода заражения зависит от биологиче­ских свойств изучаемого вируса.

Индикация вируса в курином эмбрионе производится по гибели эмбрио­на, положительной реакции гемагглютинации на стекле с аллантоисной или амниотической жидкостью, по фокусным поражениям («бляшкам») на хорион-аллантоисной оболочке.

III. Выделение вирусов на лабораторных животных.

Лабораторные животные могут быть использованы для выделения виру­сов из инфекционного материала, когда невозможно применить более удобные системы (культуры клеток или куриные эмбрионы). Берут преимущественно новорождённых белых мышей, хомяков, морских свинок, крысят. Заражают животных по принципу цитотропизма вируса: пневмотропные вирусы вводятся интраназально, нейротропные — интрацеребрально, дерматотропные — на кожу.

Индикация вируса основана на появлении признаков заболевания у жи­вотных, их гибели, патоморфологических и патогистологических изменений в тканях и органах, а также по положительной реакции гемагглтотинации с экс­трактами из органов.

Вирусы способны жить и размножаться только в клетках других организмов. Вне клеток организмов они не проявляют никаких признаков жизни. В связи с этим вирусы представляют собой либо внеклеточную покоящуюся форму (варион),

либо внутриклеточную реплицирующуюся - вегетативную . Варионы демонстрируют отменную жизнеспособность. В частности, они выдерживаютдавление до 6000атм и переносят высокие дозы радиации, однако погибают при высоких температуре, облучении УФ - лучами, а также воздействие кислот и дезинфицирующих средств.

Взаимодействии вируса с клеткой последовательно проходят несколько стадий:

1. Первая стадия представляет собой адсорбцию варионов на поверхности клетки -мишени, которая для этого должна обладать соответствующими поверхностными рецепторами. Именно с ними специфически взаимодействует вирусная частица, после чего происходит их прочное связывание, по этой причине клетки восприимчивы не ко всем вирусам. Именно этим объясняется строгая определенность путей проникновения вирусов. Например, рецепторы к вирусу гриппа имеются у клеток слизистой оболочки дыхательных путей, а у клеток кожи их нет. Поэтому через кожу гриппом заболеть нельзя - вирусные частицы для этого нужно вдохнуть с воздухом, вирус гепатита А. или В. проникает и размножается только в клетках печени, а вирус эпидемического паротита (свинка)- в клетках околоушных слюнных желез и т.д.

2. Вторая стадия состоит в проникновении целого вариона или его нуклеиновой кислоты внутрь клетки-хозяина.

3.Третья стадия называется депротеинизация . В ходе ее происходит освобождение носителя генетической информации вируса - его нуклеиновой кислоты.

4. В ходе четвертой стадии на основе вирусной нуклеиновой кислоты происходит синтез необходимых для вируса соединений.

5.В пятой стадии происходит синтез компонентов вирусной частицы - нуклеиновой кислоты и белков капсида, причем все компоненты синтезируются многократно.

6. В ходе шестой стадии из синтезированных ранее многочисленных копий нуклеиновой кислоты и белков формируются новые вирионы путем самосборки

7.Последняя - седьмая стадия - представляет собой выходвновь собранных вирусных частиц из клетки-хозяина. У разных вирусов этот процесс проходит неодинаково. У некоторых вирусов это сопровождается гибелью клетки за счет освобождения литических ферментов лизосом - лизис клетки. У других варионы выходят из живой клетки путем отпочкования, однако и в этом случае клетка со временем погибает.

Время, прошедшее с момента проникновения вируса в клетку до выхода новых варионов, называется скрытым или латентным периодом. Оно может широко варьировать: от несколько часов (5-6у вирусов оспы и гриппа) до нескольких суток(вирусы кори, аденовирусы и др.

Иной путь проникновения в клетку у вирусов бактерий - бактериофагов . Толстые клеточные стенки не позволяют белку-рецептору вместе с присоединившимся к нему вирусом погружаться в цитоплазму, как это происходит при инфицировании клеток животных. Поэтому бактериофаг вводит полый стержень в клетку и вталкивает через нее ДНК (или РНК), находящуюся в его головке. Геном бактериофага попадает в цитоплазму, а капсид остается снаружи. В цитоплазму бактериальной клетки начинается редупликация генома бактериофага, синтез его белков и формирование капсида. Через определенный промежуток времени бактериальная клетка гибнет, и зрелые фаговые частицы выходят в окружающую среду.

Бактериофаги, образующие в зараженных клетках новое поколение фаговых частиц, что приводит к лизису(разрушению) бактериальной клетки, называются вирулентными фагами .

Некоторые бактериофаги внутри клетки хозяина не реплицируются. Вместо этого их нуклеиновая кислота включается в ДНК хозяина, образуя с ней единую молекулу, способную к репликации.Такие фаги получили названия умеренных фагов , или профагов. Профаг не оказывает литического воздействия на клетку-хозяина и при делении реплицируется вместе клеточной ДНК. Бактерии, содержащие профаг, называются лизогенными. Они проявляют устойчивость к содержащемуся в них фагу, а так жек близким к нему другим фагам. Связь профага с бактерией весьма прочная, но она может быть нарушена под воздействием индуцирующих факторов(УФ - лучами, ионизирующая радиация, химические мутагены). Следует отметить, что лизигенные бактерии могут менять свойства(например, выделять новые токсины).